Анализът на полиморфизми в ITS1 региона на Haberlea rhodopensis беше извършен по следния алгоритъм:
- Подбор на популации и микроразможаване на in vitro растения от тях
- Екстракция на ДНК от свежи листа на ин витро растения (с помощта на DNeasy plant mini kit (Qiagen cat. No 69104) по оригиналния протокол.
- Оценка на качеството и чистотата на изолираната ДНК (УВ-спектрофотометрично).
- Определяне на праймери. Използвахме два универсални ITS1 праймера: ITS fw: 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ и ITS Rev 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’.
- Амплификация на ITS1 региона чрез PCR, визуализация и определяне чрез маркер на размера на амплифицирания регион.
- Лигиране на ITS1 секвенциите от трите популации Haberlea rhodopensis в компетентни бактериални клетки, клониране и изпращане на рекомбинантните плазмиди за секвениране в MWG – Biotech AG, Frankfurt, Germany.
- Анализ на данните – множествени алайнмънти на получените секвенции за локализиране на полиморфни сайтове бяха направени с помощта на софтуера Vector NTI 10.1 (Invitrogen).
Резултати
Получените PCR продукти бяха с очаквания размер (около 450 bp). Провденият онлайн online nblast в базите данни на NCBI показа висока степен на подобие на изолираните от нас ITS1 секвенции и анотираната ITS1-5,8S-ITS2 секвенция от H. rhodopansis Friv. (20)
Фиг.1. PCR продуктите след амплификацията на ITS1 региона, оцветени с етидиев бромид и визуализирани с гел-документираща система.
Множествените алайнмънти и откритите единични нуклеотидни полиморфизми (SNP) са показани на Фиг. 2
Фиг.2. Множествен алайнмънт на част от ITS1 регионите на трите изследвани популации и анотираната в NCBI секвенция от H. rhodopensis (означена като H. rhodopensis ITS1).
Получените резултати показват много висока степен на подобие между ITS1 секвенциите с произход от трите географски отдалечени популации. Единствено растенията от Централнородопския регион (Червената стена) показаха две транзиции от тимин (Т) в цитозин (С) на относителни позиции 37 и 94 в ITS1 спейсъра. Позициите на тези замени бяха определени спрямо анотираната ITS1 секвенция в NCBI (20). Тъй като екстрахирахме и амплифицирахме ДНК от по пет проби от всяка популация и продуктите бяха независимо клонирани и секвенирани, имаме основание да считаме тези полиморфизми за реални.
Първоначалните резултати от този анализ показаха че популацията от Червената стена има два единични нуклеотидни полиморфизма (SNPs) в изследвания регион, и двете са замени на тимин с цитозин, на позиции 37 и 94 от ITS1 секвенцията. Независимо от факта на географската си изолация, другите две популации показаха идентичност на ITS1 секвенцията както помежду си, така и с депонирания в NCBI вариант. Получените резултати показват, че високоповтарящият се ITS1 регион е подходящ за използване като молекулен маркер за изследване на ДНК полиморфизъм между популациите на H. rhodopensis но е добре да се комбиниpа с други маркерни секвенции, най-добре такива, които са представени с едно копие в генома.
ITS регионът на рибозомния цистрон е една от най-често използваните секвенции за анализи на филогения и полиморфизъм, понеже представлява комбинация от висококонсервативни (рРНК гените) и силно изменчиви (ETS, ITS). ITS регионът е силно вариабилен, понеже няма адаптивно значение, мутациите в него се натрупват бързо и така могат да се детектират не само междувидови, но и вътревидови различия.
Секвенциите които нямат адаптивно значение еволюират на базата на неутралния модел и могат да се използват като молекулни часовници за отчитане на времето за дивергенция между видовете или популациите. В нашия експеримент високото ниво на подобие може да означава или че популациите били изолирани наскоро, или че изолацията им не е пълна (има обмен на гени).
Може би най-интересен е фактът, че в случая скоростта на изменение изглежда не е свързана със степента на изолация. Макар че разстоянието между трите изследвани находища е приблизително еднакво (около 100 км по права линия), в Родопите има повече междинни находища, докато между Родопите и Стара планина такива няма. Затова нашите очаквания бяха повече различия да има между родопските и старопланинската популации, отколкото между двете родопски. Двете С-Т замени в популацията от Червената стена може да са знак за локално увеличаване на скоростта на мутация. Възможно е тези изменения да отразяват бързи локални молекулни събития в ITS региона, случайно фиксирани под влиянието на генния дрейф в популацията от Червената стена. Тези начални резултати показват, че можем да се натъкнем на неочаквани модели на разпространение на полиморфизмите сред популациите на Haberlea rhodopensis.
В бъдещите ни изследвания ще съчетаем анализите на ITS полиморфизми с други независими методи. Тъй като ITS секвенциите не се експресират, само чрез тях не можем да направим вързка между определени изменения в ДНК секвенцията и определени черти от фенотипа. Затова в бъдеще планираме да изследваме полиморфизми в популациите на Haberlea и Ramonda в секвенции на протеин-кодиращи гени, свързани със стреса.
За всички бъдещи сравнителни анализи, генетичната банка ин витро ще бъде особено важна като донор на растителен материал от множество популации на възкръсващите видове от сем. Gesneriaceae.